Кто изобрел пцр тесты и для чего
Как работают тесты на коронавирус и кто их сейчас создает
Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.
Что предлагает ВОЗ
Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.
Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.
Как работает ПЦР-тест
Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.
В России, по данным Роспотребнадзора, на 4 апреля было проведено более 697 тыс. ПЦР-тестов. Они проводились двумя тест-системами, разработанными новосибирским Центром вирусологии и биотехнологии «Вектор», подведомственным Роспотребнадзору — «Вектор-ПЦРрв-2019-nCoV-RG» и «Вектор-OneStepПЦР-CoV-RG» для контроля результатов первичного теста. Эти тесты были разработаны «Вектором» уже в начале января, основываясь на имеющихся данных о вирусе.
«Вектор» до конца марта оставался основным производителем тестов на COVID-19. Центр производит 500 тыс. тест-систем в неделю и обеспечивает ими государственные лаборатории. По данным производителя, он поставляется в 15 крупнейших диагностических лабораторий страны: в том числе в частные лаборатории «Хеликс» и «Гемотест».
20 марта Росздравнадзор дал разрешение на использование российско-японской диагностической системы по выявлению коронавируса, которую вывела на российский рынок компания «Эвотэк-Мирай Геномикс» (EMG). Инвестором проекта выступил Российский фонд прямых инвестиций.
Российско-японская технология для экспресс-диагностики COVID-19 является совместной разработкой японской компании «Mirai Genomics» и ее российского партнера «ООО «Генетические технологии», которая представляет собой как непосредственно тесты, так и портативные диагностические системы. Российско-японская разработка позволяет осуществлять высокоточную экспресс-диагностику вируса максимум за 30 минут. Благодаря тому, что технология адаптирована под мобильные лаборатории, она позволяет тестировать людей где угодно и может обрабатывать образцы сразу 20 человек.
Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.
Работа над мобильной платформой для диагностики велась с 2017 года в рамках одного из 30 проектов сотрудничества России и Японии. Клинические испытания проводились в Японии и России, при поддержке разработчиков «Вектора». Кроме того, испытания были проведены в Объединенных Арабских Эмиратах и Австрии. Чувствительность системы — от 5—10 копий вируса на реакцию, скорость — 18—20 минут.
В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.
Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.
Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.
Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.
Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.
Власти Москвы закупили 100 тыс. тестов и 56 мобильных диагностических систем на сумму 192 млн рублей. Запуск тестирования запланирован сразу после получения наборов. Первоочередное внимание будет направлено на стационары, где находятся люди, которые действительно нуждаются в помощи. На данным момент тесты EMG уже запущены в лабораториях сетей «Архимед», KDL и клиники «Мать и дитя».
Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.
На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.
Одним из первых, вслед за «Вектором», свой тест «Амплитест SARS-Cov-2» разработал Центр стратегического планирования и управления рисками Минздрава России (ЦСП). Создание теста началось 31 января, регистрационное удостоверение Росздравнадзор выдал 6 марта, а 27 марта центр заявил, что начал серийное производство тест-систем в Москве. Предполагаемая мощность производства составит 10 тыс. тестов в сутки, потом оно может вырасти до 50 тыс.
ЦСП заключил контракт на поставку 60 тест-систем в ФГБУ «Центральная клиническая больница» Управделами президента России. Сообщалось, что этот тест планирует использовать лаборатория «ИнВитро»: начать тестирования в своих лабораториях компания собирается в апреле.
Еще один тест разработали специалисты Федерального медико-биологического агентства (ФМБА). Их тест-система «Поливир для ПЦР-диагностики SARS-CoV-2», позволяющая сократить время анализа до 90 минут, получила государственную регистрацию 27 марта. ФМБА начало выпуск своих тест-систем 30 марта. В первую неделю агентство собирается выпустить 100 тыс. тестов, в дальнейшем — по 200 тыс. тестов еженедельно. Высокая чувствительность тест-системы позволяет обнаружить даже низкие концентрации нуклеиновых кислот коронавируса (103 молекулы).
На разных стадиях разработки и готовности к регистрации находятся тесты еще около 10 компаний — например, новосибирская компания «Вектор-бест», «Система-Биотех» («дочка» «АФК-Системы»), «Тестген» и компания «ДНК-технологии».
По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.
Новые разработки за рубежом
Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.
Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.
FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.
Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.
Изобретатель ПЦР Кэри Муллис о бесполезности ПЦР в обнаружения инфекции (1 фото + 2 видео)
Хотя весь мир полагается на RT-PCR (ПЦР) для «диагностики» инфекции Sars-Cov-2, науке уже давно было известно, что ПЦР не подходят для этой цели.
Блокировки и санитарные-эпидемиологические меры во всем мире основаны на количестве случаев и показателях смертности, созданных с помощью так называемых тестов SARS-CoV-2 RT-PCR, используемых для выявления «положительных» пациентов, при этом «положительный» обычно приравнивается к «инфицированному», что в корне неверно и преступно.
Но если внимательно присмотреться к фактам, то можно сделать вывод, что эти ПЦР-тесты не имеют смысла в качестве диагностического инструмента для определения предполагаемой инфекции предположительно новым вирусом под названием SARS-CoV-2.
НЕОБОСНОВАННАЯ МАНТРА «Тестирование, Тестирование, Тестирование…»
На брифинге для СМИ по COVID-19 16 марта 2020 генеральный директор ВОЗ Тедрос Адханом Гебрейесус сказал:
«У нас есть простое послание для всех стран: тестируйте, тестируйте, тестируйте»
Еще 3 мая модератор журнала Heute — одного из самых важных новостных журналов на немецком телевидении — передавал своей аудитории мантру этой догмы:
» Тестировать, тестировать, тестировать — это кредо на данный момент, и это единственный способ действительно понять, насколько быстро распространяется коронавирус»
Это указывает на то, что вера в достоверность тестов ПЦР настолько сильна, что соответствует религии, которая практически не терпит противоречий.
Итак, для начала, очень примечательно, что сам Кэри Муллис, изобретатель технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР), говорил, что ПЦР не подходит для диагностики инфекции. Хотя его изобретение принесло ему Нобелевскую премию по химии в 1993 году.
К сожалению, Муллис скончался в прошлом году в возрасте 74 лет, но нет никаких сомнений в том, что его не стало т.к. он считал ПЦР непригодным для выявления вирусной инфекции.
Причина в том, что предполагаемое использование ПЦР было и остается применением в качестве производственного метода, позволяющего воспроизводить последовательности ДНК миллионы и миллиарды раз, а не в качестве диагностического инструмента для обнаружения вирусов.
ПЦР — хорошо подходит для установления отцовства, а также для поимки преступников, т.е. в криминалистики.
Как объявление вирусных пандемий на основе тестов ПЦР может закончиться катастрофой, описала Джина Колата в своей статье в New York Times 2007 года « Вера в быстрое тестирование ведет к эпидемии, которой не было»
ОТСУТСТВИЕ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ЗОЛОТОГО СТАНДАРТА
Более того, стоит упомянуть, что тесты ПЦР, используемые для выявления так называемых пациентов с COVID-19, предположительно инфицированных так называемым SARS-CoV-2, не имеют действующего золотого стандарта для их сравнения.
Это принципиальный момент. Тесты необходимо оценивать, чтобы определить их точность, строго говоря, их «чувствительность» и «специфичность» — путем сравнения с «золотым стандартом», то есть наиболее точным из доступных методов.
Если бы у нас был новый тест на обнаружение [бактерии] золотистого стафилококка в крови, у нас уже были посевы крови на питательных средах, это наш золотой стандарт, который мы использовали в течение десятилетий, и мы могли бы сопоставить этот новый тест с этим. Но для COVID-19 у нас нет золотого стандарта.
Но вместо того, чтобы классифицировать тесты как непригодные для обнаружения SARS-CoV-2 и диагностики COVID-19 или вместо того, чтобы указывать на то, что только вирус, подтвержденный путем выделения и очистки (изоляция вируса), может быть твердым золотым стандартом, ВОЗ со всей серьезностью заявляет, сам анализ ПЦР, «может быть лучшим доступным «золотым стандартом »». Но это не научно обосновано.
НЕТ ДОКАЗАТЕЛЬСТВ ВИРУСНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ РНК
Теперь вопрос: что требуется в первую очередь для изоляции / доказательства существования вируса?
Нам нужно знать, откуда берется РНК, для которой калибруются тесты ПЦР.
В качестве учебников (например, White / Fenner. Medical Virology, 1986), а также от ведущих исследователей вирусов, таких как Люк Монтанье или Доминик Дуайер, очистка частиц — то есть отделение объекта от всего остального, что не является этим объектом вируса, как, например, лауреат Нобелевской премии Мария Кюри в 1898 году очистила 100 мг хлорида радия, извлекая его из тонн урана — это необходимое предварительное условие для доказательства существования вируса, таким образом, доказательства того, что РНК рассматриваемой частицы исходит от нового вируса.
Причина этого в том, что ПЦР чрезвычайно чувствительна, что означает, что она может обнаруживать даже самые маленькие кусочки ДНК или РНК, но не может определить, откуда эти частицы. Это должно быть определено заранее.
И поскольку тесты ПЦР откалиброваны по последовательностям генов (в данном случае последовательностям РНК, поскольку SARS-CoV-2 считается РНК-вирусом), мы должны знать, что эти фрагменты генов являются частью искомого вируса. И чтобы знать это, необходимо выполнить правильное выделение и очистку предполагаемого вируса.
Поэтому мы обратились к научным группам, занимающимся соответствующими статьями, которые упоминаются в контексте SARS-CoV-2, для доказательства того, показывают ли электронно-микроскопические снимки, сделанные в их экспериментах in vitro (вне живого организма), очищенными вирусами.
Но ни одна команда не смогла ответить на этот вопрос «да».
Мы получили только ответы типа «Нет, мы не получали электронную микрофотографию, показывающую высокую степень очистки».
Мы спросили нескольких авторов исследования: «Показывают ли ваши электронные микрофотографии очищенный вирус?», Они дали следующие ответы:
Что касается упомянутых документов, ясно, что то, что показано на электронных микрофотографиях (ЭМ), является конечным результатом эксперимента, а это означает, что нет другого результата, из которого они могли бы сделать ЭМ.
То есть, если авторы этих исследований признают, что их опубликованные ЭМ не показывают очищенные частицы, то они определенно не содержат очищенных частиц, которые, как утверждается, являются вирусными. (В этом контексте следует отметить, что некоторые исследователи используют термин «выделение» в своих статьях, но описанные в них процедуры не представляют собой надлежащий процесс выделения (очистки). Следовательно, в этом контексте термин «выделение» является неправильно использованный.
Таким образом, авторы четырех основных работ начала 2020 года, в которых утверждается, что был обнаружен новый коронавирус, признают, что у них нет доказательств того, что геном вируса произошел от вирусоподобных частиц или клеточного мусора, чистого или нечистого, или частиц любого вида.
Другими словами, существование РНК SARS-CoV-2 основано на вере, а не на фактах.
Мы также связались с доктором Чарльзом Калишером, опытным вирусологом.
В 2001 году журнал Science опубликовал «горячую просьбу… к молодому поколению» от нескольких ветеранов-вирусологов, в том числе Калишера, в которой говорилось, что:
«современные методы обнаружения вирусов, такие как полимеразная цепная реакция: мало или ничего не говорят о том, как размножается вирус, какие животные его переносят, или как он вызывает болезни у людей. Это все равно что пытаться сказать, что у кого-то неприятный запах изо рта, глядя на его отпечаток пальца»
доктор Чарльз Калишер
И поэтому мы спросили доктора Калишера, знает ли он хоть одну статью, в которой SARS-CoV-2 был изолирован и, наконец, действительно очищен. Его ответ:
» Я не знаю такой публикации. Я присматривал за каждой».
доктор Чарльз Калишер
Фактически это означает, что нельзя сделать вывод о том, что последовательности генов РНК, которые ученые взяли из образцов тканей, подготовленных в упомянутых испытаниях in vitro и для которых окончательно «калибруются» тесты ПЦР, принадлежат определенному вирусу — в данном случае SARS-CoV-2.
НЕ СОБЛЮДЕНЫ ПОСТУЛАТЫ КОХА
Кроме того, нет научных доказательств того, что эти последовательности РНК являются возбудителем того, что называется COVID-19.
Чтобы установить причинную связь, так или иначе, то есть помимо выделения и очистки вируса, было бы абсолютно необходимо провести эксперимент, который удовлетворял бы четырем постулатам Коха.
Микроорганизм/вирус постоянно встречается в организме больных людей (или животных) и отсутствует у здоровых.
Микроорганизм/вирус должен быть изолирован от больного человека (или животного) и его штамм должен быть выращен в чистой культуре.
Чтобы только выделить его каждый раз нужны огромные средства.
При заражении чистой культурой микроорганизма/вируса здоровый человек (или животное) заболевает.
Кто это делал: заражал людей, да никто, это невозможно. А животные не дадут четкой картины.
Микроорганизм/вирус должен быть повторно изолирован от экспериментально заражённого человека (или животного).
Но такого эксперимента нет и не было, как недавно рассказали Эмори Деверо и Розмари Фрей.
Показательно, что ни один из ведущих немецких представителей официальной теории SARS-Cov-2 / COVID-19:
— Институт Роберта Коха (RKI), Александр С. Кекуле (Университет Галле),
Хартмут Хенгель и Ральф Бартеншлагер (Немецкое общество) по вирусологии),
вышеупомянутые Томас Лёшер, Ульрих Дирнагл (Шарите Берлин) или Георг Борнкамм (вирусолог и почетный профессор Гельмгольц-центра Мюнхена) — могли бы ответить на следующий вопрос, который им отправили:
Если частицы, которые, как утверждается, принадлежат к SARS-CoV-2, не были очищены, как вы хотите быть в этом уверены, что последовательности генов РНК этих частиц принадлежат конкретному новому вирусу?
Но мы не получили ответов до 18 июня 2020 года, после нескольких месяцев отсутствия ответа. В конце концов, мы добились этого только с помощью берлинского юриста Вивиан Фишер.
Шарите признает, что они не использовали очищенные частицы.
Вирусологи из клиники Шарите заявляют:
«РНК экстрагировали из клинических образцов с помощью системы MagNA Pure 96 (Roche, Penzberg, Германия) и из супернатантов клеточных культур с помощью мини-набора вирусной РНК (QIAGEN, Hilden, Германия)».
Между прочим, Corman et al. Документ, опубликованный 23 января 2020 года, даже не прошел надлежащего процесса рецензирования, и описанные в нем процедуры не сопровождались контролем — хотя только благодаря этим двум вещам научная работа становится действительно научной.
НЕРАЦИОНАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕСТОВ
Также несомненно, что мы не можем узнать уровень ложноположительных результатов ПЦР-тестов без широко распространенного тестирования людей, у которых определенно нет вируса, подтвержденного этим методом, не зависящим от теста (имеющим твердый золотой стандарт).
Поэтому неудивительно, что существует несколько работ, иллюстрирующих иррациональные результаты тестов.
Даже Ван Чен, президент Китайской академии медицинских наук, признал в феврале, что тесты ПЦР «точны только на 30–50 процентов», в то время как Син Ханг Ли из Милфордской лаборатории молекулярной диагностики 22 марта 2020 г. отправил письмо группе реагирования на коронавирус ВОЗ и Энтони С. Фаучи, заявив, что:
В социальных сетях широко сообщалось, что тест-наборы RT-qPCR [количественная ПЦР с обратной транскриптазой], используемые для обнаружения РНК SARSCoV-2 в образцах человека, дают много ложноположительных результатов и недостаточно чувствительны для выявления некоторых реальных положительных случаев. ”
Другими словами, даже если мы теоретически предположим, что эти ПЦР-тесты действительно могут обнаружить вирусную инфекцию, тесты будут практически бесполезными и вызовут только необоснованный страх среди «положительных» людей.
Все это согласуется с тем фактом, что CDC и FDA, например, признают в своих файлах, что так называемые «тесты SARS-CoV-2 RT-PCR» не подходят для диагностики SARS-CoV-2.
В «CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) в режиме реального времени RT-PCR Диагностическая панель» Файл от 30 марта 2020 года, к примеру, он говорит:
Обнаружение вирусной РНК может не указывать на наличие инфекционного вируса или на то, что 2019-nCoV является возбудителем клинических симптомов »
Этот тест не может исключить заболевания, вызванные другими бактериальными или вирусными патогенами ».
И FDA признает, что :
«положительные результаты, не исключают бактериальную инфекцию или коинфекцию другими вирусами. Обнаруженный агент может не являться определенной причиной заболевания».
ВЫСОКИЕ ЗНАЧЕНИЯ CQ ДЕЛАЮТ РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕСТА ЕЩЕ БОЛЕЕ БЕССМЫСЛЕННЫМИ
Другая важная проблема заключается в том, что многие тесты ПЦР имеют значение «количественной оценки цикла» (Cq) более 35 циклов, а некоторые, включая «тест Drosten PCR», даже имеют Cq 45.
Значение Cq указывает, сколько циклов репликации ДНК требуется для обнаружения реального сигнала от биологических образцов.
MIQE означает «Минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени», набор руководящих принципов, которые описывают минимальную информацию, необходимую для оценки публикаций по ПЦР в реальном времени, также называемой количественной ПЦР или qPCR.
Сам изобретатель Кэри Муллис согласился, когда заявил :
Если вам нужно пройти более 40 циклов для амплификации гена с единственной копией, с вашей ПЦР что-то серьезно не так ».
Рекомендации MIQE были разработаны под эгидой Стивена А. Бустина, профессора молекулярной медицины, всемирно известного эксперта по количественной ПЦР и автора книги AZ по количественной ПЦР, которую назвали «библией количественной ПЦР
Источник: www.youtube.com