геномная терапия что это такое
Что такое генно-инженерная терапия?
Принимать ГИБП можно лишь по заключению врача
Генно-инженерная терапия — это современная терапия с применением генно-инженерных биологических препаратов. Генно-инженерные биологические препараты (ГИБП) — это лекарственные средства, различными по механизму действия. Они могут блокировать и ингибировать цитокиновые рецепторы, являются гуманизированными или человеческими моноклональными антителами и.т.д.
Говоря простым языком, в препаратах имеются молекулы, способные прерывать взаимодействия между клетками хозяина и субстанциями, провоцирующими бесконтрольное воспаление.
Такие лекарства используют только ревматологи?
Нет. Также эти препараты используют гематологи, онкологи, гастроэнтерологи, офтальмологи и неврологи, но назначаться они могут только узкоспециализированными экспертами. Ревматолог не может назначить терапию онкологическому пациенту, гастроэнтеролог — пациенту офтальмолога.
Всем ли пациентам с аутоиммунной патологией можно назначать такую терапию?
Связано ли это с высокой стоимостью препаратов?
Экономический аспект, естественно, имеет значение. Но во главу угла ставится здоровье пациента. Это довольно новая группа препаратов, нуждающаяся в крайне аккуратном и выверенном назначении. До первого введения или приема медикамента пациент должен быть детально обследован, необходимо оценить активность заболевания. Необходимо, чтобы это была не субъективная оценка самочувствия, а ряд исследовательских индексов активности. Помимо этого, должна быть доказана неэффективность других лекарственных средств.
Стоит ли приобретать генно-инженерные препараты, не попробовав другие лекарства?
Нет! Это серьезное решение, и принимается оно совместно с врачом — нужно взвесить все «за» и «против».
За генной инженерией будущее, а цитостатики — вчерашний день?
Это совсем не так. Нельзя делить лекарства по принципу «новое — значит надёжное, а старое — неэффективное». Это в корне неверно, а иногда и крайне опасно.
Можно ли принимать такие препараты без заключения ревматолога?
Данная группа средств требует регулярного взаимодействия с ревматологом. Самолечение может привести к огромному количеству проблем, например: отсутствие лекарственного обеспечения, ускользание эффекта, нежелательные побочные явления и обострение скрытых инфекций. Даже несколько инъекций, выполненных без назначения и контроля ревматолога, могут привести к плачевным исходам. Это авантюра, которая в некоторых случаях может привести к летальному исходу. Принимать ГИБП можно лишь по заключению врача, который умеет работать с ними и осуществлять контроль безопасности. Это очень важно.
Запишитесь на консультацию к врачу-ревматологу в медицинский центр «Неббиоло» и получите ответы на все интересующие вас вопросы о генно-инженерной биологической терапии!
Что такое генная инженерия и зачем вмешиваться в природу организмов
Содержание:
Генная инженерия — это современное направление биотехнологии, объединяющее знания, приемы и методики из целого блока смежных наук — генетики, биологии, химии, вирусологии и так далее — чтобы получить новые наследственные свойства организмов.
Перестройка генотипов происходит путем внесения изменений в ДНК (макромолекулу, обеспечивающую хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов) и РНК (одну из трех основных макромолекул, содержащихся в клетках всех живых организмов).
Если внести в растение, микроорганизм, организм животного или даже человека новые гены, можно наделить его новой желательной характеристикой, которой до этого он никогда не обладал. С этой целью сегодня генная инженерия используется во многих сферах. Например, на ее основе сформировалась отдельная отрасль фармацевтической промышленности, представляющая собой одну из современных ветвей биотехнологии.
История развития
Истоки
Основы классической генетики были заложены в середине XIX века благодаря экспериментам чешского-австрийского биолога Грегора Менделя. Открытые им на примере растений принципы передачи наследственных признаков от родительских организмов к их потомкам в 1865 году, к сожалению, не получили должного внимания у современников, и только в 1900 году Хуго де Фриз и другие европейские ученые независимо друг от друга «переоткрыли» законы наследственности.
Параллельно с этим шел процесс формирования знаний о ДНК. Так, в 1869 году швейцарский биолог Фридрих Мишер открыл факт существования макромолекулы, а в 1910 году американский биолог Томас Хант Морган обнаружил на основе характера наследования мутаций у дрозофил, что гены расположены линейно на хромосомах и образуют группы сцепления. В 1953 году было сделано важнейшее открытие — американец Джон Уотсон и британец Фрэнсис Крик установили молекулярную структуру ДНК.
На подъеме
К концу 1960-х годов генетика активно развивалась, а ее важными объектами стали вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов, а в 1970-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК.
Генная инженерия как отдельное направление исследовательской работы зародилась в США в 1972 году, когда в Стэнфордском университете ученые Пол Берг, Стэнли Норман Коэн, Герберт Бойер и их научная группа внедрили новый ген в бактерию кишечной палочки (E. coli), то есть создали первую рекомбинантную ДНК.
Техника ПЦР была впервые разработана в 1980-х годах американским биохимиком Кэри Маллисом. Будущий лауреат Нобелевской премии по химии (1993 года), обнаружил в специфический фермент — ДНК-полимеразу, который участвует в репликации ДНК. Этот фермент буквально считывает отрезки цепи нуклеотидов молекулы и использует их в качестве шаблона для последующего копирования генетической информации.
Новая эра
В 1996 году методом пересадки ядра соматической клетки в цитоплазму яйцеклетки на свет появилось первое клонированное млекопитающее — овца Долли. Это событие стало революционным в истории развития генной инженерии, потому что впервые стало возможным серьезно говорить о создании клонов и выращивании живых организмов на основе молекул.
Технологии генной инженерии
Генная инженерия за короткий срок оказала огромное влияние на развитие различных молекулярно-генетических методов и позволила существенно продвинуться на пути познания генетического аппарата.
Так, появилась технология CRISPR — инструмент редактирования генома. В 2014 году MIT Technology Review назвал его «самым большим биотехнологическим открытием века». Он основан на защитной системе бактерий, которые производят специальные ферменты, позволяющие им защищаться от вирусов.
«Каждый раз, когда бактерия убивает вирус, она разрезает остатки его генома, будь то ДНК или РНК, и сохраняет их внутри последовательности CRISPR, как в архив. Как только вирус атакует снова, бактерия использует информацию из «архива» и быстро производит защитные белки Cas9, в которых заключены фрагменты генома вируса. Если вдруг эти фрагменты совпадают с генетическим материалом нынешнего атакующего вируса, Cas9 как ножницами разрезает захватчика, и бактерия снова в безопасности», — поясняет Алевтина Федина, медицинский директор Checkme.
Уникальное открытие состоялось в 2011 году, когда биологи Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье обнаружили, что белок Cas9 можно обмануть. Если дать ему искусственную РНК, синтезированную в лаборатории, то он, найдя в «архиве» соответствие, нападет на нее. Таким образом, с помощью этого белка можно резать геном в нужном месте — и не просто резать, а еще и заменять другими генами.
Теоретически, технология CRISPR может позволить редактировать любую генетическую мутацию и излечивать заболевание, которое она вызывает. Но практические разработки CRISPR в качестве терапии еще только в начальной стадии, и многое еще непонятно.
Есть и другие методы генной инженерии, например, ZFN и TALEN.
Где и как применяется генная инженерия
Медицина
Уже сейчас активно применяется инсулин человека (хумулин), полученный посредством рекомбинантных ДНК. Клонированные гены человеческого инсулина были введены в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. С 1982 года компании США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин.
Кроме того, несколько сотен новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику. Среди лекарств, находящихся в стадии клинического изучения, препараты, потенциально лечащие артрозы, сердечно-сосудистые заболевания, онкологию и СПИД. Среди нескольких сотен генно-инженерных компаний 60% заняты именно разработкой и производством лекарственных и диагностических средств.
«В медицине среди достижений генной инженерии сегодня можно выделить терапию рака, а также другие фармакологические новинки — исследования стволовых клеток, новые антибиотики, прицельно бьющие по бактериям, лечение сахарного диабета. Правда, пока все это на стадии исследований, но результаты многообещающие», — говорит Алевтина Федина.
Сельское хозяйство
В сельском хозяйстве одна из важнейших задач генной инженерии — получение растений и животных, устойчивых к вирусам. В настоящее время уже есть виды, способные противостоять воздействию более десятка различных вирусных инфекций.
Еще одна задача связана с защитой растений от насекомых-вредителей. Путем генетической модификации растений можно уменьшить интенсивность обработки полей пестицидами. Например, трансгенные растения картофеля и томатов стали устойчивы к колорадскому жуку, растения хлопчатника — к разным насекомым, в том числе и к хлопковой совке.
Использование генной инженерии позволило сократить применение инсектицидов (препаратов для уничтожения насекомых) на 40–60%.
Благодаря генной инженерии зерновые культуры стали более устойчивы к климатическим условиям, кроме того появилась возможность увеличить количество витаминов и полезных веществ в продукте. Например, можно обогатить рис витамином «А» и выращивать его в тех регионах, где люди имеют массовую нехватку этого элемента.
С помощью генной инженерии пытаются решить и экологические проблемы. Так, уже созданы особые сорта растений с функцией очистки почвы. Они поглощают цинк, никель, кобальт и иные опасные вещества из загрязненных промышленными отходами почв.
Скотоводство
В Кемеровской области работа генетиков позволила получить устойчивое к вирусу лейкоза племенное поголовье высокопродуктивных животных. Для проведения эксперимента кузбасские ученые отобрали здоровых коров черно-пестрой породы массой до 500 кг. Животным трансплантировали модифицированные эмбрионы, устойчивые к вирусу лейкоза. В середине сентября 2020 года родилось 19 телят с измененными генами.
«В месячном возрасте была проведена оценка, которая показала, что телята отличаются от своих сверстников только устойчивостью к вирусу. Пять особей отобрали для дальнейшей селекционной работы. Это позволит закрепить наследственные признаки устойчивости к вирусу лейкоза у последующих поколений», — пояснила руководитель проекта, доктор биологических наук, профессор кафедры зоотехнии Кузбасской ГСХА Татьяна Зубова.
По словам Зубовой, лейкоз крупного рогатого скота — вирусная хронически неизлечимая болезнь, при которой возникают поражение кроветворной системы и новообразования. Данное заболевание наносит значительный ущерб генофонду пород и мясной промышленности в целом, потому что мясо зараженных животных запрещено употреблять в пищу. Единственным доступным методом борьбы с лейкозом ранее было только уничтожение зараженного скота.
Этот успех позволяет говорить о том, что в дальнейшем будет возможно редактировать гены крупного рогатого скота и от других болезней.
С прицелом на человека
В 2009 году группа ученых под руководством молодого исследователя Джея Нейтца из Вашингтонского университета сумели с помощью генной терапии вернуть обезьянам способность различать оттенки зеленого и красного, которой они были лишены от рождения.
В область сетчатки глаза двух подопытных обезьян был введен безвредный вирус, несущий недостающий ген фоточувствительного рецептора. Вскоре после процедуры обе обезьяны начали различать оттенки красного и зеленого на сером фоне. Два года наблюдения не выявили у них каких-либо нарушений, поэтому ученые не исключают, что данную методику уже вскоре можно будет применять у людей, страдающих дальтонизмом.
Ученые шагнули еще дальше и уже пробуют выращивать в теле животных органы для трансплантации людям. Для минимизации риска отторжения тканей животным вводят специальные гены. Этими опытами занимается научная лаборатория Рослинского института в Великобритании, которая представила миру овцу Долли.
В 2019 году британские ученые вывели кур, яйца которых содержат два вида человеческих белков, способных противодействовать артриту и некоторым видам онкологических заболеваний. В яйцах содержится человеческий белок под названием IFNalpha2a, обладающий мощными противовирусными и противораковыми свойствами, а также человеческий и свиной вариант белка под названием макрофаг-CSF, который планируют использовать для создания препарата, стимулирующего самостоятельное заживление поврежденных тканей.
Изменение ДНК человека
Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы.
14 сентября 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей наследственным иммунодефицитом, обусловленным мутацией в гене аденозиндезаминазы (АDA), были пересажены ее собственные лимфоциты.
Работающая копия гена ADA была введена в клетки крови с помощью модифицированного вируса, в результате чего клетки получили возможность самостоятельно производить необходимый белок. Через шесть месяцев количество белых клеток в организме девочки поднялось до нормального уровня.
После этого область генной терапии получила толчок к дальнейшему развитию. С 1990-х годов сотни лабораторий ведут исследования по использованию генной терапии для лечения различных заболеваний. Уже сегодня с помощью генной терапии можно лечить диабет, анемию и некоторые виды онкологии.
Генная терапия
Генная терапия — введение, удаление или изменение генетического материала, в частности ДНК или РНК, в клетке пациента для лечения определенного заболевания.
Существует три основных стратегии использования генной терапии:
Наиболее часто применяемый метод включает вставку «терапевтического» гена для замены «ненормального» или «вызывающего болезнь».
В 2015 году впервые была проведена процедура изменения ДНК человека с целью продления молодости клеток, когда американке Элизабет Пэрриш 44 лет ввели в организм препарат, влияющий на ДНК, а в 2018 году китайский ученый Хэ Цзянькуй заявил, что с его помощью у двух детей-близнецов якобы изменены гены для выработки у них иммунитета к вирусу ВИЧ, носителем которого являлся их отец.
Все это, с одной стороны, выглядит грандиозно и обнадеживает, но с другой, — вызывает опасения, ведь генетические манипуляции, теоретически, возможно использовать не только в благих и мирных целях.
После эксперимента с ДНК близнецов в Китае, ЮНЕСКО выступила с инициативой о запрете изменения генов у новорожденных до того момента, пока достоверно не будет доказана безопасность таких манипуляций.
Этическая сторона вопроса
В 1997 году ЮНЕСКО выпустила Всеобщую декларацию о геноме человека и его правах, рекомендовав мораторий на генетическое вмешательство в зародышевую линию человека, а в декабре 2015 года на международном саммите по геномному редактированию человека изменение гаметоцитов и эмбрионов для генерации наследственных изменений у людей было объявлено безответственным.
Российское сообщество генетиков в большинстве своем считает, что такие эксперименты на данный момент преждевременны и требуют более глубокого исследования и обсуждений.
«Вопрос клонирования уже давно стоит на горизонте. Этично ли выращивать клонов, чтобы потом забирать их органы для трансплантации человеку… Большой вопрос. Само собой, это абсолютно нормально, что нет единой точки зрения, ведь смысл подобных дискуссий как раз в том, чтобы найти правильные формулировки и отрегулировать потенциально спасительное, но при этом очень опасное знание», — говорит Алевтина Федина.
Страх неизвестности
Вариантов развития событий в области генной инженерии существует множество, и далеко не все они изучены и, в принципе, известны. Поэтому они должны быть последовательно зафиксированы и регламентированы.
Естественно, больше всего опасений вызывают плохие сценарии развития событий. Как правило, все начинается с помощи людям и изобретения новых лекарств. Но потом человек может прийти к желанию сделать своего ребенка светловолосым и зеленоглазым или создать армию универсальных солдат, не боящихся боли и не ведающих страха.
Олег Долгицкий, социальный философ, отмечает, что современное общество настолько неоднородно в культурном и экономическом плане, что любые методы, способные существенно изменить геном, могут создать условия не только для классового, но и видового расслоения, где представители «первого мира» смогут существенно продлевать свою жизнь и не бояться никаких болезней, в отличие от менее богатых людей. Это является серьезнейшей почвой для конфликтов и столкновений.
Эксперты убеждены, что генная инженерия — это будущее медицины. Возможность избавить младенца от пожизненного гнета заболевания, излечить людей от рака, найти лекарство против ВИЧ — за всем этим будет стоять генная инженерия. При этом желание человека изменить, например, цвет глаз или предотвратить наследственное заболевание, несмотря на все риски, будет только расти. И похоже, что остановить этот процесс уже не представляется возможным.
Геномная терапия что это такое
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, Москва, Россия
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, Москва, Россия
ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России
ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздрава России
Генная терапия — новое направление в медицине
Журнал: Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 2016;5(2): 64-72
Безбородова О. А., Немцова Е. Р., Якубовская Р. И., Каприн А. Д. Генная терапия — новое направление в медицине. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 2016;5(2):64-72.
Bezborodova O A, Nemtsova E R, Iakubovskaia R I, Kaprin A D. Gene therapy is a new area in medicine. P.A. Herzen Journal of Oncology. 2016;5(2):64-72.
https://doi.org/10.17116/onkolog20165264-72
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, Москва, Россия
В обзоре приведены сведения об истории и направлениях развития генной терапии. Обсуждены типы трансгенов, применяемые в лечении различных заболеваний, специфические и конституциональные промоторы, обеспечивающие экспрессию терапевтических трансгенов в клетках-мишенях, способы доставки генных конструкций в целевые клетки и механизмы внедрения генетического материала в ядро клетки. Рассмотрены преимущества и недостатки вирусных и невирусных векторов различных типов. Приведены данные последних лет о клиническом применении официнальных препаратов для генной терапии, зарегистрированных для лечения больных со злокачественными опухолями головы и шеи (Gendicine и Oncorine, Китай), с моногенным заболеванием — дефицитом липопротеиназы (Glybera, Нидерланды) и с ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза (неоваскулген, Россия), а также о клинических испытаниях препаратов для генной терапии в различных областях медицины.
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, Москва, Россия
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, Москва, Россия
ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России
ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздрава России
Достижения молекулярной биологии и генетики в изучении тонкой структуры генов эукариот, картирование генов на хромосомах млекопитающих, их идентификация и клонирование, обнаружение мутаций в генах, ассоциированных с наследственными и приобретенными заболеваниями, наряду с бурным ростом в области биотехнологий, клеточных технологий и успехами генной инженерии привели к тому, что в конце прошлого века начался бум в исследованиях по анализу молекулярно-биохимических дефектов, ассоциированных с определенной патологией, который привел к пониманию того, что большинство грозных заболеваний человека сопровождается серьезными изменениями в генетическом аппарате клетки. Особенно выражены и наиболее исследованы эти изменения при злокачественных новообразованиях. Из этих данных следует логичный вывод о том, что наиболее радикальным способом борьбы с заболеваниями, вызываемыми изменениями в генетическом аппарате клеток, должны быть мероприятия, направленные непосредственно на причину заболевания, а не ее последствия.
Генная терапия — это лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекционных, злокачественных и др.) заболеваний путем введения генов в соматические клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых свойств.
История развития генной терапии началась в 1972 г., когда в США, в Стэндфордском университете, Стэнли Коэн и Герберт Бойер обнаружили явление прямого переноса фрагментов ДНК от одной бактерии кишечной палочки к другой при непосредственном контакте этих клеток. А уже в 1974 г. в США была учреждена первая в мире биотехнологическая компания «Genetech», где выращивали новые бактериальные культуры с чужими генами.
В 1976 г. в Университете Пенсильвания, США, Уильям Андерсон предложил использование вирусов в качестве носителей ДНК, а в 1990 г. этот исследователь в клинике Университета Пенсильвания ввел больной Ашанти ДеСильва с синдромом комбинированного иммунодефицита (СКИД) генетически модифицированные геном аденозиндезаминазы ее собственные лимфоциты, в последующие 3 года провел 23 внутривенных трансфузии и получил длительную ремиссию, а затем выздоровление.
В то же время метод генной терапии все шире распространялся по миру и к настоящему моменту в мире проведено и проводится более 2210 клинических испытаний по генной терапии. География их широка и разнообразна. Это — Америка (63,9%), Европа (24,1%), Азия (6,0%), Австралия (1,5%), международные (4,2%) [1]. По странам имеется распределение, свидетельствующее о том, что эта технология наиболее развита в США и ряде Европейских стран.
Спектр заболеваний, при которых проводятся клинические испытания по генной терапии, также чрезвычайно широк (табл. 1). Независимо от нозологии, в области соматической генной терапии имеются общие задачи. Это:
Таблица 1. Клинические испытания в области генной терапии
— выбор наиболее эффективного для лечения гена;
— разработка способов доставки требуемого гена в нужные клетки;
— изучение и обеспечение эффективных подходов и способов нужной регуляции гена;
— вопросы длительности существования и экспрессии введенного гена;
— обеспечение безопасности больного.
Типы генов, используемых при генной терапии, разнообразны, и их выбор определяется патогенетическими механизмами развития заболевания, идентификацией наиболее болезнетворных генов.
Наиболее простая задача в выборе гена стоит при моногенных наследственных заболеваниях, то есть там, где показано, что определенный дефект в данном гене вызывает патологический процесс. Совершенно другая задача по степени сложности в выборе гена для терапии стоит при многофакториальных заболеваниях, таких как злокачественные новообразования, кардиоваскулярные болезни, при которых в патогенезе заболеваний, во-первых, пока много неясного, во-вторых, задействован ряд генов.
Типы генов, описанные для клинических исследований, варьируют очень широко. Среди них 20,2% относятся к генам антигенов, 16,2% — цитокинов, 9,4% — различных рецепторов, 8,6% — факторов иммунодефицита, 7,4% — к «суицидным» генам, 7,4% — к генам факторов роста, 4,2%— ингибиторов репликации, 2,5% — маркеров, 13,2% — к генам других категорий белков, 2,5% — к неизвестным генам [1].
Для эффективной работы выбранный терапевтический ген снабжают сигнальными (регулирующими) элементами, которые необходимы для синтеза полноценной мРНК и целевого белка, а также позволяют управлять специфичностью экспрессии в определенном типе клеток или ткани, длительностью функционирования и нужной регуляцией гена в клетке (рис. 1) [2, 3].
Рис. 1. Схема генно-терапевтической конструкции.
Специфичность экспрессии генов в заданной клетке достигается конструированием векторов, несущих терапевтические гены под контролем промоторов, работающих только в данном типе клеток. К настоящему моменту выявлен ряд тканеспецифичных промоторов, обеспечивающих селективную экспрессию терапевтических трансгенов в клетках определенных органов. В экспериментальной генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний в настоящее время используют промоторы, которые обеспечивают преимущественную экспрессию трансгена в миокарде (SM22α-промотор и др.) [4]. Разработан целый ряд тканеспецифичных промоторных систем, в которых использованы гены, высокоэкспрессированные, главным образом, в опухолевых клетках: простатспецифический и простатспецифический мембранный антигены при раке предстательной железы [5], гены, кодирующие сурфактантные белки, А и В, при раке легкого [6, 7], ген мембранно-связанного муцина MUC1/DF3 при раке молочный железы, трахеи, легкого, тонкого или толстого кишечника [8], ген α-фетопротеина — белка, синтезируемого в печени, при раке печени [9], промоторы гена сурвивина человека (hSurv) и гена обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT), обеспечивающих экспрессию трансгена в клетках широкого спектра опухолей [10, 11] (табл. 2).
Таблица 2. Опухолеспецифичные промоторы
Поскольку тканеспецифичные промоторы обладают общим недостатком — низким уровнем экспрессии гетерологичных генов, а также ограниченной областью применения, обусловленной их тканеспецифичностью, в настоящее время идет активный поиск промоторов генов человека, не обладающих тканевой специфичностью — универсальных или гибридных промоторов, направленных исключительно на пролиферирующие клетки и не затрагивающих нормальные дифференцированные клетки.
Одной из сложнейших проблем в генной терапии является доставка требуемого гена в нужные ткани при минимизации его контакта с биологическими средами организма до достижения клетки-мишени, а также обеспечение доставки гена в нужную клетку с целью его эффективной и безопасной работы в ней.
В настоящее время генетический материал доставляется в клетку либо в виде «голой» ДНК («naked DNA»)/плазмиды, в том числе в составе наночастиц и липосом, либо с использованием векторов вирусной и невирусной природы, защищающих ДНК от разрушения и имеющих тропность к определенным тканям (рис. 2) [12].
Рис. 2. Системы доставки генетического материала в клетку. (Адаптировано по: Thomas SM, Grandis JR. The Current State of Head and Neck Cancer Gene Therapy. 2009; Y20: 1565—1575 [12])
Самым простым способом доставки трансгенов является доставка «голой» ДНК/плазмиды. При этом для целей доставки генетического материала в ядро клетки используется арсенал различных средств. Это может быть физический метод доставки ДНК с применением таких приемов, как прямая инъекция «голой» ДНК, электропорация клеток и доставка ДНК через поры в обработанных мембранах, бомбардировка частицами с ДНК с использованием гидродинамической пушки [13].
На долю «голой» и плазмидной ДНК приходится всего 17,4% протоколов клинических испытаний в области генной терапии, что обусловлено их низкой трансфицирующей способностью. Это обстоятельство является большим ограничением для использования такого генетического материала в разработке метода генной терапии, несмотря на наличие у него ряда неоспоримых преимуществ: отсутствие инфекционности, низкая иммуногенность, высокая технологичность (доступность в получении в высокоочищенном состоянии в больших количествах, стандартность, стабильность при хранении и т. д.).
Альтернативным способом доставки терапевтических генов является использование векторов вирусной, бактериальной и химической природы. Вектор должен эффективно и специфически трансфицировать/трансдуцировать делящиеся и неделящиеся таргетные клетки, экспрессировать трансген в адекватных количествах в течение длительного времени, производиться легко и рентабельно по количеству и качеству, не быть иммуногенным и использоваться для повторного введения гена, являться безопасным при введении и не иметь побочных эффектов.
В качестве векторов для доставки генетического материала в клетку-мишень используют самые разнообразные вирусы, но наиболее распространены векторы на основе аденовируса (ADV), аденоассоциированного вируса, ретро- (RV), лентивируса (LV) и вируса простого герпеса (HSV) (табл. 3). При этом нативные полные вирусные частицы никогда не используются в качестве векторов, так как в этом случае есть опасность встраивания их генетического материала в клетки хозяина с целью приобретения метаболических и биосинтетических продуктов для вирусной транскрипции и репликации. Поэтому вирусы предварительно подвергаются существенной генетической модификации, приводящей к утере их репликационной способности и повышению тропизма к тканям и клеткам.
Таблица 3. Вирусные векторы для генной терапии
Вирусные векторы достаточно хорошо изучены, они имеют высокую эффективность трансфекции in vivo, для их наработки существуют коммерческие паковочные клеточные линии. Векторы на основе аденовируса и аденоассоциированных вирусов не встраиваются в геном клетки, а остаются эпихромосомными. Это уменьшает опасность мутагенеза, который может быть индуцирован при внедрении вируса в геном. При конструировании специфически направленных аденовирусных векторов эффективной оказалась замена вирусных промоторов, контролирующих основные транскрипционные области, так называемыми транскрипционными регуляторами, в результате чего экспрессия гена и репликация вируса происходят преимущественно в целевых клетках [14, 15].
Ретровирусные векторы интегрируют в геном хозяина, что при генной терапии обеспечивает стабильность и стойкую экспрессию трансгена в дочерних клетках, однако несет риск инсерционного мутагенеза, который может вызывать инактивацию генов-супрессоров опухолевого роста или активации онкогенов [16].
Необходимо отметить, что вирусные векторы обладают и другими недостатками. Так, они могут нести лишь небольшое количество генетического материала (до 30 кб). Кроме того, аденовирусные векторы 1-го поколения, в которых присутствуют все вирусные гены, обладают выраженной иммуногенностью, которая обусловливает развитие как клеточного, так и гуморального иммунного ответа, что приводит к разрушению не только самого вектора, но и клеток, трансдуцированных ими, и как следствие к ограничению срока экспрессии трансгена в 2—3 нед после трансдукции [17]. В настоящее время проблема иммуногенности таких векторов для генной терапии решается путем разработки конструкций, практически полностью лишенных вирусных генов, так называемых «gutless» вирусов или хелперзависимых (HD)/Ad векторов [18]. Исследования in vivo показали перспективность использования HD/Ad векторов для трансдукции клеток сосудистой системы и миокарда [19].
Несмотря на описанные недостатки, вирусный метод доставки трансгенов в клетки успешно развивается и в настоящее время является доминирующим: около 70% клинических исследований посвящено изучению генетических конструкций, снабженных вирусными векторами.
В то же время в последние годы активно разрабатываются невирусные системы доставки генетического материала с использованием высокомолекулярных химических соединений для конденсации с ДНК: липидсвязанные комплексы — липоплексы либо поликатионные комплексы, имитирующие поверхность вируса — полиплексы (табл. 4). Эти наночастицы защищают плазмидную ДНК в межклеточном пространстве от деградации нуклеазами и облегчают проникновение в клетки-мишени. Положительно заряженные комплексы связываются со специфическими рецепторами (при наличии на их поверхности макромолекул, обладающих свойствами специфического лиганда) или непосредственно с поверхностью клетки. Комплексы проникают в клетку по механизму эндоцитоза. После высвобождения из эндосомы и разборки комплекса нуклеиновая кислота проникает через поры в ядро клетки [20].
Таблица 4. Невирусные векторы для генной терапии
Невирусные системы на основе катионных липидов или полимеров имеют ряд преимуществ перед вирусными системами доставки: большой объем несущей ДНК, отсутствие какой-либо вирусной составляющей, а следовательно, низкая иммуногенность, высокая технологичность производства. Однако низкая трансфицирующая способность невирусных векторов и недостаток информации о безопасности у человека тормозят развитие исследований в этом направлении, только 5,2% приходится на клинические испытания, где в качестве системы доставки терапевтических генов используют липоплексы или полиплексы.
К настоящему моменту сформировалось два типа геннотерапевтического воздействия: индивидуализированный подход ex vivo — трансфекция стволовых гемопоэтических клеток, полученных из периферической крови и трансплантированных затем больному, и in vivo — трансфекция клеток внутри организма, куда генетический материал в составе вектора доставляется в результате внутривенной или внутриартериальной (в печеночную артерию) инфузии, внутримышечного, подкожного, интратуморального, интраназального или сублингвального введения. В практике лечения сердечно-сосудистых заболеваний испытываются прямые игольные инъекции конструкций в миокард, введение вирусных векторов при помощи разнообразных катетеров, использование стентов с покрытиями, обеспечивающими дозированный выход лекарственного средства. В онкологии используют, как правило, внутриопухолевое введение целевого гена в составе различных векторов.
На долю заболеваний, для которых разрабатываются методы генной терапии, большая часть приходится на злокачественные новообразования. Злокачественная трансформация клетки происходит в результате накопления генетических дефектов, приводящих к их аномальному росту, непосредственной причиной которых является дисбаланс в пролиферации и гибели клеток. Поэтому разработка способов коррекции этих дефектов является основой генной терапии злокачественных новообразований. Подходы к генной терапии рака включают в себя три основные стратегии: введение нормального гена в опухолевые клетки для замены «мутантного» гена, генетическую модификацию, преследующую цель заглушить «мутантный» ген, и генетические подходы, направленные на запуск гибели опухолевых клеток (табл. 5).
Таблица 5. Подходы к генной терапии онкологических заболеваний
Представления о патогенезе злокачественных новообразований, в основе которого, в том числе, лежат активация онкогенов и инактивация генов-супрессоров опухолевого роста, позволяют искать пути подавления или восстановления функции этих генов.
К настоящему моменту известно более 24 генов-супрессоров, среди них наиболее изученным является ген р53, контролирующий клеточный цикл и поврежденный в ≈50% опухолей человека [21]. Так, коррекционная замена мутантного гена p53 в опухолевых клетках геном дикого типа (не содержащим мутаций) с помощью методов генотерапии приводила к восстановлению функций белка p53 и инициации процессов, запускающих программированную гибель злокачественных клеток. Клинические испытания аденовирусного вектора Ad-p53 показали, что восстановление дикого типа р53 путем доставки гена при помощи дефектного по репликации Ad приводило к значительному противоопухолевому эффекту на фоне низкой общей токсичности [22]. Более того, восстановление р53 сопровождалось увеличением чувствительности опухолевых клеток к химио- и радиотерапии [23].
Технология «молчащих» генов — одна из новейших технологий в генотерапии рака, направлена на сайленсинг (silence — молчание) генов, отвечающих за рост и/или деление раковых клеток, так называемых онкогенов. «Заглушить» гены можно за счет адресной доставки малых интерферирующих двухцепочечных РНК (siRNA), которые блокируют экспрессию гена в результате гомологичной рекомбинации (РНК-интерференция) [24, 25]. Также малые РНК, образующие «шпильки» во вторичной структуре (shRNA), могут быть использованы для подавления экспрессии генов путем РНК-интерференции.
Направленная доставка siRNA была апробирована в клинических испытаниях: CALAA-01 («Calando Pharmaceuticals») для пациентов с меланомой [26] и ALN-VSPOI («Alnylam Pharmaceuticals») для лечения рака печени и других солидных опухолей [27]. Предварительные результаты исследования CALAA-01 и ALN-VSPOI показали безопасность и хорошую переносимость siRNA, что является подтверждением целесообразности продолжения испытаний для продвижения данного подхода к лечению заболеваний онкологического профиля.
Одним из активно развивающихся направлений генной терапии рака является энзиматическая терапия (Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy, GDEPT), основанная на запуске гибели опухолевых клеток за счет придания им способности превращать вводимый в организм препарат-предшественник в токсичный метаболит. Это достигается введением «суицидных» генов, кодирующих фермент вирусного или бактериального происхождения, который в клетках, где он экспрессируется, конвертирует свой субстрат, превращая его из нетоксичного пролекарства в токсичный для клетки метаболит [28]. Наиболее изученными системами «суицидный» ген/пролекарство являются: ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk)/ганцикловир, ген цитозиндезаминазы (CD)/5-фторцитозин, цитохром P450 (p450)/циклофосфамид и другие [29]. Основная проблема, препятствующая применению этой стратегии в клинической практике, — довольно низкая эффективность доставки терапевтических генов. Несмотря на это, число проведенных клинических испытаний GDEPT растет с каждым годом [1]. Среди препаратов, предназначенных для GDEPT, можно выделить Sitimagene ceradenovec (Cerepro, «Ark Therapeutics Group Plc», Великобритания и Финляндия) на основе аденовирусного вектора со встроенным «суицидным» геном HSVtk. Этот препарат прошел I/II фазы клинических испытаний (глиома), в которых показана безопасность внутриопухолевой доставки вирусной тимидинкиназы в глиальные клетки, при этом отмечена стабилизации процесса у пациентов [30, 31].
Генная терапия рака, направленная на разрушение опухолевых клеток, возможна с использованием вирусов, которые с помощью специальных генетических манипуляций становятся онколитическими, т. е. селективно воздействуют только на опухолевые клетки, вызывают лизис инфицированных клеток и последующую трансдукцию окружающих опухолевых клеток, что в несколько раз увеличивает их терапевтический индекс. Существуют две основные стратегии получения онколитических вирусов: путем делеции (мутации) основных вирусных генов, функции которых могут быть восполнены только в опухолевых, но не в нормальных клетках (делеционные мутанты), и путем регуляции экспрессии основных вирусных генов за счет помещения их под ткане- или опухолеспецифичные транскрипционные регуляторные элементы (транскрипционная регуляция). Препараты на основе онколитических вирусов разрабатывают с использованием РНК- и ДНК-содержащих вирусов, таких как аденовирус, реовирус, вирус простого герпеса, поксвирус. Так, клинические испытания онколитических вирусов ONYX-015 и Н101 на основе мутантных аденовирусов с делецией в гене Е1В и с делецией в генах Е1В и Е3 соответственно, которые селективно реплицируются в опухолевых клетках с дефектным р53, показали безопасность и эффективность при интратуморальном введении в терапии ряда опухолей [32, 33]. В настоящее время проходят клинические испытания препарата REOLYSIN («Oncolitic Biotech. Inc.», Канада), полученного на основе штамма Т3D реовируса человека. В этих исследованиях показана низкая токсичность при внутриопухолевом и внутривенном его введении в режиме монотерапии, а в сочетании с противоопухолевыми препаратами, такими как гемцитабин для рака поджелудочной железы и легкого, доцетаксел для рака мочевого пузыря, предстательной железы и легкого, паклитаксел с карбоплатином для меланомы, рака легкого и яичников, показана высокая противоопухолевая эффективность [34].
Наиболее успешным онколитическим препаратом является OncoVexGMCSF на основе вируса простого герпеса, который проходит II/III фазы клинических испытаний для лечения меланомы, рака молочной железы, опухолей головы и шеи. В геноме этого вируса сохранен ген тимидинкиназы для проведения GDEPT, но удалены обе копии ICP34.5 гена, отвечающего за вирусную репликацию в нормальных клетках, а в область ICP47 встроен ген GM-CSF. Продуцируемый GM-CSF привлекает дендритные клетки (DC) и может стимулировать выброс цитотоксических Т-лимфоцитов [35].
Следует отметить, что современная стратегия развития иммунотерапии рака на фоне расширяющихся знаний о функционировании иммунной системы и формировании иммунного ответа является главной предпосылкой для усовершенствования подходов к лечению с привлечением инновационных лекарственных средств, созданных методами генной инженерии, таких как генные вакцины.
Исследования в этой области ведутся в трех направлениях: модификация опухолевых клеток для придания им большей иммуногенности, введение генов опухолеассоциированных антигенов в дендритные клетки, геномодификация лимфоцитов для повышения цитотоксического ответа.
К настоящему моменту разработана «платформа», представляющая собой два рекомбинантных вектора: на основе поксвирусов коровьей оспы (RV) для первичной вакцинации и птичьей оспы (RF) для ревакцинации с тремя костимуляторными молекулами [В7.1 (CD80), ICAM-1 (CD54) и LFA-3 (CD58), обозначаемыми TRICOM] для повышения иммунного ответа [36—38]. Каждый из этих векторов может содержать трансген для одного или нескольких опухолевых антигенов, например, таких как гены, кодирующие простатспецифический антиген (PSA), раково-эмбриональный антиген (СЕА), мембранно-связанный муцин (MUC-1) и другие. Разработаны вакцины PROSTVAC (RV-, RF-PSA-TRICOM) для иммунотерапии рака предстательной железы [39, 40] и PANVAC (RV-, RF-СЕА-MUC1-TRICOM) для иммунотерапии рака молочной железы, прямой кишки, яичников. Полученные на сегодняшний день результаты применения вакцин выглядят обнадеживающими в плане их переносимости. Однако в плане эффективности наблюдается лишь непродолжительная стабилизация процесса. Несмотря на это, синергизм иммунотерапии и химиотерапии, полученный в ряде клинических испытаний, является подтверждением целесообразности применения вакцин в сочетании с другими методами лечения [41].
Метод, известный как технология химерных антигенных рецепторов, или CAR-технология (от англ. chimeric antigen receptor), в настоящее время является одним из наиболее перспективных и быстро развивающихся направлений в области иммунотерапии злокачественных новообразований [42]. Эта технология заключается в выделении из периферической крови пациента Т-лимфоцитов и их двухкомпонентной модификации в условиях ex vivo: присоединение к их поверхности рецептора, распознающего экспрессируемый большинством лейкемических клеток белок CD19, и введение мощного внутриклеточного механизма, запускающего активный рост и деление клеток в ответ на их взаимодействие с белком-мишенью. Такие генномодифицированные Т-лимфоциты возвращают в кровоток пациента. Предварительные результаты исследований свидетельствуют о том, что этот подход позволяет получить хорошие результаты у 2/3 пациентов, не ответивших на традиционные методы лечения [43—45].
Микроокружение опухоли играет важную роль в прогрессии и метастазировании. Оно включает в себя строму с фибробластами и эндотелиальными клетками сосудов. Вмешательство в эту микросреду также может привести к регрессии опухоли. Наиболее важной «точкой приложения» является ангиогенез. В условиях опухолевого роста активируется выброс проангиогенных цитокинов, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VЕGF) и фактор роста фибробластов (FGF). Эти факторы стимулируют рост микрососудов вокруг опухоли с последующей прогрессией и метастазированием. Альтернативой терапии рекомбинантным (гуманизированным) моноклональным антителом бевацизумаб, которое селективно связывает и ингибирует активность VEGF, может стать генная терапия. Предварительные результаты клинических испытаний показали, что доставка антиангиогенных генов, кодирующих белки ангиостатин и эндостатин с помощью аденоассоциированного вектора, вызывает регрессию опухоли с минимальными побочными эффектами [15].
Таким образом, генная терапия достигла определенных успехов: разработаны подходы, сконструировано более 2 тыс. препаратов, прошедших доклинические исследования, проведены клинические испытания в ряде областей медицины. К настоящему моменту в мире уже зарегистрировано четыре препарата для генной терапии (табл. 6). Гендицин (Shenzhen SiBiono GenTech) и Oncorine (H101) (Sunway Biotech Co) — это первые генно-терапевтические препараты, допущенные к клиническому применению в Китае в 2003 и 2005 г. соответственно, для лечения плоскоклеточного рака головы и шеи [46]. Препарат Glybera (uniQurо), созданный на основе аденоассоциированного вектора, в геном которого встроен вариант гена липопротеиназы LPL s447x для лечения моногенного заболевания — дефицита липопротеиназы, вызванного мутацией в гене, кодирующем выработку этого фермента, допущенный к применению в 2012 г. Европейским агентством по оценке лекарственных препаратов (EMA) [47]. Препарат неоваскулген, представляющий собой высокоочищенную сверхскрученную плазмиду с геном VEGF165, кодирующий эндотелиальный фактор роста сосудов под контролем цитомегаловирусного промотора, предназначен для лечения пациентов с ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза и зарегистрирован в России в 2011 г. [48].
Таблица 6. Официнальные препараты для генной терапии различных заболеваний
В настоящий момент в России, так же как и за рубежом, продолжается развитие этого метода. Так, во II фазе клинических испытаний находятся цельноклеточные генномодифицированные вакцины аллоген (из клеточной линии меланомы человека mel P/tag7) и мелавак (из клеточной линии меланомы mel Ког/GM-CSF), показавшие безопасность и эффективность при лечении меланомы [49]. На стадии клинических испытаний находится препарат канцеролизин, разработанный на основе аденовируса 5-го типа, у которого был полностью делетирован ген белка Е1 В по аналогии с известным штаммом ONYX-015 (ФГУН ГНЦ «Вектор», Россия) [50]. I фазу клинических испытаний проходит препарат АдеЛакт («НТфарма», Россия), представляющий собой рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген лактоферрина человека (hLf). Этот препарат, предназначенный для терапии токсикозов различного генеза III и IV степени, проходил доклинические испытания в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена — филиале ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России [51]. На этой же базе идут доклинические испытания АнтионкоРАН-М — препарата для противоопухолевой «суицидной» терапии на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk) и колониестимулирующего фактора (GM-CSF) с невирусной системой доставки, разработанного в результате совместных исследований, проведенных в ФГБУН ИМГ РАН, ФГБУН ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и МГУ им. М.В. Ломоносова [52].
Заключение
Таким образом, использование метода генной терапии может быть результатом уже не столь отдаленного будущего, но говорить о реальных перспективах этого направления в медицине, по-видимому, пока преждевременно. Несмотря на то, что большинство клинических испытаний свидетельствует об относительной безопасности геннотерапевтических препаратов, требуется время для окончательного доказательства их эффективности. Возможно, в будущем метод генной терапии станет основным в лечении наследственных заболеваний, а для заболеваний онкологического профиля генная терапия будет рассматриваться как часть комплексного противоопухолевого лечения.