генетическая вакцина что такое
Что необходимо знать о мРНК-вакцинах: 5 позиций
В результате беспрецедентной скорости в разработке новых вакцин, миру были представлены первые клинически одобренные мРНК-вакцины
В результате беспрецедентной скорости в разработке новых вакцин, миру были представлены первые клинически одобренные мРНК-вакцины для борьбы с пандемией Covid-19 – одна из них произведена Pfizer и BioNTech, другая – компанией Moderna. Испытания показали эффективность этих вакцин на уровне не менее чем 94%.
1. Технология мРНК вакцин не так молода, как кажется
Классический механизм работы вакцин (например, против полиомиелита и гриппа) заключается в презентации иммунной системе инактивированных частиц вируса. Другие вакцины (например, против гепатита B) используют отдельно взятый белок, являющийся частью инфекционного агента, чтобы вызвать схожий иммунный ответ.
мРНК-вакцины работают по другому принципу, «обманывая» иммунную систему таким образом, что РНК (в основном матричная мРНК) кодирует белок, который продуцируется в клетке путем трансляции и представляется иммунной системе; он действует как антиген. Иммунная система учится избирательно бороться с клетками, экспрессирующими такие антигены, такими как клетки-хозяева, инфицированные вирусами, или опухолевые клетки.
Хотя вакцины от Pfizer/BioNTech и Moderna – первые препараты, одобренные в клинической практике, сама технология мРНК-вакцин существует относительно давно. Первые испытания в онкологии с использованием схожих технологий берут свое начало еще в 2011 году.
2. мРНК-вакцины не изменяют ДНК
Существуют абсолютно необоснованные опасения, что мРНК-вакцины способны изменять ДНК. На самом же деле мРНК не входит в ядро клетки, а после своего введения биодеградирует в течение нескольких дней. Именно поэтому для формирования полноценного иммунного ответа необходимо 2 инъекции препарата.
3. мРНК-вакцины имеют высокую специфичность
Вирус SARS-CoV-2 имеет достаточно сложную структуру и его различные части стимулируют иммунную систему на образование нейтрализующих антител, которые не всегда способны эффективно элиминировать инфекцию. мРНК-вакцины стимулируют иммунный ответ к спайк-белку вируса, являющегося только частью вирусной мембраны.
4. Разработчики и эксперты не «срезали углы» во время клинических испытаний
Испытания вакцин начались с доклинической фазы, проводимой на животных, а затем постепенно переходили на 1-ую, 2-ую и 3-ю фазы. Например, 3-я фаза вакцины от Pfizer/BioNTech включает более 40 000 человек, исследования эффективности и безопасности будут продлжаться следующие 2 года.
Основные проблемы, связанные с использованием вакцины, обычно возникают в первые 2 месяца. Тем не менее, не исключены редкие побочные эффекты на больших выборках в миллионы людей, поэтому за вакцинированными необходимо пристальное наблюдение, особенно с учетом инновационной природы технологии.
5. Вакцина запускает воспалительные реакции
Частично вакцина работает путем индуцирования локальных иммунных реакций, поэтому воспалительные признаки в месте инъекции и небольшой дискомфорт в первые дни – вполне нормальное явление.
Противоопухолевые ДНК-вакцины
Frontiers in Bioscience 11, 1189-1198, January 1, 2006
DNA VACCINES FOR CANCER
Denise R. Shaw, Theresa V. Strong
Медицинский факультет, кафедра гематологии и онкологии и комплексный онкологический центр университета штата Алабама (Бирмингем).
Перевод: Евгения Рябцева, портал «Вечная молодость» www.vechnayamolodost.ru
Оглавление
1. Резюме
2. Введение
3. Перенос генов для иммунизации
4. Механизм развития иммунного ответа при ДНК-вакцинации
5. Факторы, влияющие на индукцию иммунного ответа
6. Стратегии усиления иммунного ответа
7. Клинический опыт использования ДНК-вакцин
8. Перспективы
9. Благодарность
10. Литература
ДНК-вакцины, также называемые генетическими, плазмидными или полинуклеотидными вакцинами, представляют собой относительно простой и экономичный метод применения переноса генов для иммунизации против опухолеспецифических антигенов. В данном обзоре обсуждаются потенциальные преимущества ДНК-вакцин для иммунотерапии рака по сравнению с традиционными белковыми вакцинами и вирусными векторами. Кроме того, в статье описаны предполагаемые механизмы индукции иммунного ответа, развивающегося в ответ на ДНК-иммунизацию. Проанализированы также имеющиеся на настоящий момент результаты доклинических разработок ДНК-вакцин и клинический опыт ДНК-иммунизации в лечении рака. Низкий уровень токсичности, присущий ДНК-вакцинам, свидетельствует в пользу продолжения работы в этом направлении, однако для успешного внедрения этого подхода в клиническую практику необходима разработка дополнительных стратегий повышения эффективности существующих препаратов.
При производстве первых противоопухолевых вакцин в качестве агентов, вызывающих иммунный ответ на ассоциированные с опухолями антигены, использовали белки или клетки. Методики переноса генов предоставили новые возможности стимуляции иммунного ответа. Среди спектра методик, разрабатываемых для клинического применения, ДНК-вакцины (также называемые нуклеиновыми, полинуклеотидными, плазмидными или генетическими вакцинами) появились как эффективный новаторский метод запуска антигенспецифичного противоопухолевого иммунного ответа.
ДНК-вакцинация основана на использовании плазмидных (кольцевых) молекул ДНК, кодирующих целевой антиген. Этот метод доставки обладает рядом преимуществ, наиболее важным из которых, возможно, является то, что он запускает как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. Синтез закодированного в плазмиде белка in vivo обеспечивает его дальнейший процессинг для презентации в комплексе с антигенами главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC) I класса, что способствует формированию цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) I класса. Цитотоксические Т-лимфоциты считают важными медиаторами противоопухолевого иммунного ответа, а их активация в ответ на опухолевые антигены играет решающую роль в эффективности противоопухолевых вакцин. Кроме того, в отличие от белковых вакцин, производимых с помощью бактерий, синтез антигена in vivo обеспечивает правильный фолдинг (сворачивание в трехмерную структуру) и посттрансляционное модифицирование белковой молекулы. Вакцины на основе ДНК также вызывают долговременную экспрессию антигена и, соответственно, стойкий иммунный ответ.
К дополнительным факторам, благоприятствующим разработке плазмидных стратегий ДНК-иммунизации, относятся относительная простота и низкая стоимость производства таких вакцин, а также их стабильность. Как более детально описано ниже, ДНК-вакцины, производимые с помощью бактерий, по своей природе являются иммуностимуляторами, что обусловлено присутствием в их структуре неметилированных цитозин-гуаниновых динуклеотидов (cytosine guanine (CpG) dinucleotides). Эта последовательность стимулирует неспецифический иммунный ответ, не препятствующий повторным введениям вакцины. Такая особенность выгодно отличает ДНК-вакцины от вакцин на основе вирусов, эффективность которых может сильно снижаться из-за предсуществовавшего или индуцированного вектором иммунного ответа (1,2). Параметры безопасности также свидетельствуют в пользу полинуклеотидных вакцин по сравнению с вирусными, так как при работе с ними не существует риска рекомбинации с вирусами дикого типа и очень низок риск инсерционного мутагенеза. И, наконец, ДНК-вакцины можно использовать для быстрой доставки нескольких эпитопов и даже нескольких антигенов в одной инъекции, что, учитывая склонность опухолей к уклонению от иммунного распознавания путем утраты антигенных вариантов, является очень важным фактором (3).
Несмотря на эти потенциальные преимущества и многообещающие результаты доклинических исследований, в клинических условиях противоопухолевые ДНК-вакцины до сих пор демонстрировали минимальную активность. Многие опухолевые антигены не содержат мутаций, поэтому развитие направленного против них иммунного ответа подразумевает способность иммунной системы распознавать и запускать эффективный ответ против «собственного» антигена организма. Результаты предварительных исследований свидетельствуют о том, что этого достаточно сложно добиться в отношении опухолей человека. Поэтому повышение активности и, соответственно, клинической эффективности полинуклеотидных вакцин стало основной целью работы в этой области исследований. Предлагаемый вашему вниманию обзор дает представление о ряде подходов, разработанных с целью преодоления этих ограничений и в настоящее время тестируемых на доклинических моделях.
3. Перенос генов для иммунизации
Предпосылкой к разработке вакцин на основе нуклеиновых кислот послужило наблюдение Wolff и др., которые установили, что внутримышечное введение депротеинизированной ДНК ведет к экспрессии закодированного в ней гена клетками мышечных волокон (4). Последующие работы продемонстрировали применимость этого подхода к экспрессии чужеродных генов в клетках различных видов, начиная от рыб (5) и заканчивая приматами (кроме человека) (6). Несмотря на низкую эффективность процесса, введенная внутримышечно ДНК проникает внутрь мышечных волокон через ямки на поверхности миоцитов и Т-канальцы (7,8). ДНК сохраняется в ядрах клеток-рецепторов в экстрахромосомной форме, однако ее экспрессия регистрируется в течение длительного периода времени (9), продолжительность которого зависит от иммуногенности закодированного в ней белка. Используя плазмиду, кодирующую белок вируса гриппа – нуклеопротеин А, – Ulmer и др. впервые продемонстрировали способность внутримышечного введения ДНК, кодирующей вирусный белок, презентируемый антигенпрезентирующими клетками (АПК) в комплексе с антигенами MHC класса I, вызывать опосредуемый CD8+ Т-лимфоцитами защищающий от инфицирования иммунный ответ (10). Результаты этого исследования послужили доказательством целесообразности разработки ДНК-вакцин для лечения различных заболеваний, в том числе рака.
Индукция клеточного и гуморального иммунного ответа при введении ДНК-вакцин не ограничена внутримышечным введением. Кожа содержит много АПК, таких как незрелые клетки Лангерганса в эпидермисе и зрелые дендритные клетки (ДК) в дерме. Tang и др. продемонстрировали способность проникающей через кожу ДНК запускать иммунный ответ на закодированный в ней белок (11). В рамках этой работы ДНК осаждали на золотые микрочастицы, которые наносили на кожу под давлением с помощью баллистического устройства (12). Этот процесс, обычно называемый доставкой генов с помощью генной пушки, не травмирует кожный покров и для формирования иммунного ответа требует гораздо меньше ДНК, чем внутримышечное введение (13,14). Индукцию эффекторных ЦТЛ, опосредующих отторжение опухолей, впоследствии продемонстрировали на мышиной модели перевиваемых опухолей (15). Внутрикожную иммунизацию можно также осуществлять посредством инъекций депротеинизированной ДНК или введения покрытых ДНК наночастиц с помощью систем для безыгольного впрыскивания (16). Рассматривают также вариант нанесения ДНК-вакцин на слизистые оболочки, что, в первую очередь, актуально для иммунизации против инфекционных заболеваний (17), однако может быть применимо и для лечения рака (18). И, наконец, несмотря на относительно короткое время полураспада в кровотоке, работы по внутриселезеночному введению ДНК-вакцин (19) продемонстрировали, что стратегии, способствующие поглощению внутривенно введенной ДНК спленоцитами, могут приводить к формированию гуморального и клеточного иммунного ответа. То, что все эти методы доставки приводят к синтезу антигенов и индукции антигенспецифичного иммунного ответа, указывает на универсальность ДНК-вакцинации. Важным моментом является также то, что различные методы введения вакцин могут приводить к развитию качественно отличающихся иммунных реакций (20,21), а их относительную эффективность для человека еще предстоит определить.
4. Механизм развития иммунного ответа при ДНК-вакцинации
Изучение способности ДНК-вакцин вызывать развитие клеточного иммунного ответа подготовило почву для их разработки в качестве средства противоопухолевой терапии. Механизмы индукции иммунного ответа при ДНК-иммунизации до сих пор не до конца ясны, однако, судя по всему, они включают процессинг антигена с помощью эндо- и экзогенных механизмов, обеспечивающих презентацию антигена в комплексе с белками MHC I и II класса. ДНК может трансфектировать как клетки-мишени (например, миоциты при внутримышечном введении), так и входящие в состав ткани АПК. Несмотря на то, что миоциты синтезируют закодированный в ДНК белок, только АПК обеспечивают костимуляторный сигнал, необходимый для эффективной активации ЦТЛ. Результаты ряда работ указывают на то, что центральная роль в индукции иммунного ответа на ДНК-иммунизацию принадлежит АПК костномозгового происхождения (22-25). Эти данные предполагают «перекрестную презентацию» антигена антигенпрезентирующими клетками. Антиген синтезируется миоцитами и переносится в АПК таким образом, что процессированные пептиды презентируются на их поверхности в комплексе с белками MHC I класса, наделяя АПК способностью непосредственно активировать ЦТЛ. Это противоречит обычной ситуации, когда белки, попадающие в АПК экзогенным путем, перемещаются в эндолизосомальную систему для деградации и презентации в комплексе с молекулами MHC II класса. Альтернативно либо дополнительно может происходить трансфекция самих АПК нуклеиновой кислотой (26,27). In vivo синтез антигенов в цитоплазме АПК обеспечивает презентацию пептидов в комплексе с молекулами MHC I класса. Презентация антигена совместно с молекулами MHC I и II класса в присутствии соответствующих костимуляторных молекул, экспрессируемых АПК, ведет к активации как CD4+, так и CD8+ T-клеток, обеспечивая одновременное развитие клеточного и гуморального иммунного ответа.
Создание с помощью нокаута генов мышиных моделей с избирательными нарушенными элементами иммунной системы позволило сформулировать более четкое определение факторов, критичных для индукции эффективного иммунного ответа (28). Изучение механизмов отторжения опухолей, опосредованное терапевтической ДНК-вакциной в трансгенной мышиной модели рака молочной железы, продемонстрировало скоординированное функционирование CD4+ и CD8+ клеток, антител, Fc-рецепторов, перфоринов, гамма-интерферона, CD1d-рестриктированных Т-лимфоцитов с активностью неспецифических киллеров (NKT) и макрофагов, а также важную роль активированных нейтрофилов, способных непосредственно лизировать опухолевые клетки и повреждать питающую опухоли сосудистую сеть (29,30).
5. Факторы, влияющие на индукцию иммунного ответа
Ряд характеристик ДНК-вакцин определяет характер и выраженность вызываемого ими иммунного ответа. Состав ДНК является первоочередным параметром, характеризующим плазмидные вакцины. Динуклеотид CpG относительно слабо представлен в геноме млекопитающих, и богатые CpG зоны ДНК часто метилированы в результате функционирования механизма регуляции транскрипции. Синтезируемые бактериями ДНК-плазмиды, напротив, содержат неметилированные динуклеотиды CpG, распознаваемые механизмами врожденного иммунитета как показатель присутствия патогена (31). Эти последовательности распознаются toll-подобными рецепторами-9 (toll-like receptor 9, TLR9) и запускают активацию ДК, макрофагов, натуральных киллеров и NKT-клеток (32,33). В результате последовательности CpG, входящие в состав плазмид либо очищенных олигодеоксинуклеотидов (ОДН), являются мощными адъювантами и могут запускать иммунный ответ, опосредованный Т-хелперами 1 типа (Тх1) (34). ОДН, содержащие CpG, также оказывают антиапоптотический эффект на CD4+ и CD8+ клетки (35). Присутствие CpG-последовательностей значительно усиливает общую иммуногенность ДНК-вакцин.
Кроме состава нуклеиновых кислот, важным фактором, определяющим иммунный ответ, является уровень экспрессии трансгена. В целом, повышенная экспрессия иммуногена усиливает иммунный ответ. Поэтому для обеспечения эффективной транскрипции закодированного в плазмиде гена необходим сильный промотор, а оптимизированные сигналы полиаденилирования и наличие нетранслируемых регионов могут способствовать экспрессии трансгена (36). Активность цитомегаловирусного раннего промотора/энхансера, широко используемого для запуска экспрессии закодированной последовательности, можно усилить путем встраивания дополнительных последовательностей, например, выделенных из ДНК аденоассоциированного вируса (37).
При создании оптимизированного вектора метод его введения также влияет на развивающийся иммунный ответ. В предыдущем разделе обсуждалось, что различные методы ДНК-иммунизации ведут к развитию клеточного и гуморального иммунного ответа, однако природа иммунного ответа, развивающегося при использовании различных подходов к иммунизации, может отличаться качественно (20,21,38,39,40). В целом, введение ДНК с помощью генной пушки запускает иммунный ответ с более выраженным участием Т-хелперов-2 (Тх2), характеризующийся сильным гуморальным компонентом, не очень эффективным при лечении опухолей. Однако этот эффект можно модифицировать посредством одновременного введения цитокинов, стимулирующих активность Тх1 (41). На характер иммунного ответа можно также повлиять путем подбора оптимальных доз и схем вакцинации (13,42).
Антигенность закодированного белка чрезвычайно важна для формирования эффективного иммунного ответа. То, что большинство опухолевых антигенов являются «собственными», является труднопреодолимым барьером на пути к разработке эффективных методов иммунотерапии рака. Изменение антигенности белка или стимуляция его поглощения АПК являются ключевыми моментами, рассматриваемыми в аспекте решения этой проблемы. Локальный профиль цитокинов также играет важную роль в формировании окончательного иммунного ответа. Оптимизация всех этих факторов с целью максимального повышения эффективности иммунного ответа при ДНК-иммунизации стала основной целью исследований.
6. Стратегии усиления иммунного ответа
ДНК-вакцины продемонстрировали свою перспективность в отношении стимуляции эффективной реакции ЦТЛ в ответ на неоантигены, однако слабые антигенные характеристики многих опухолей требуют большей эффективности противоопухолевых вакцин для обеспечения целесообразности их клинического применения. Поэтому многие исследования посвящены усилению вызываемого ДНК-вакцинами иммунного ответа. Ученые проанализировали каждый аспект вакцинации, от введения нуклеиновой кислоты до модификации закодированного в ней антигена и изменения микроокружения для максимального усиления иммунного ответа и его сдвига в сторону участия Тх1 (табл. 1). Универсальность ДНК-вакцин является важным преимуществом, так как и с нуклеиновой кислотой, и с закодированным антигеном можно проводить различные манипуляции.
Таблица 1. Стратегии усиления эффективности полинуклеотидных противоопухолевых терапевтических вакцин.
Тип доставки нуклеиновой кислоты
Модификация антигена для обеспечения его поглощения АПК
Модификация антигена с целью повышения его иммуногенности
— изменение процессинга антигена
— внедрение иммуногенных эпитопов
— использование антигена другого вида
— одновременное введение цитокинов
— одновременное введение хемокинов
Так как процесс доставки нуклеиновой кислоты внутрь клеток-мишеней неэффективен, подходы к улучшению доставки и/или повышению стабильности ДНК in vivo могут приводить к более выраженной и продолжительной экспрессии закодированного антигена, что способствует повышению силы иммунного ответа. Одним из вариантов является внедрение нуклеиновой кислоты в липосомы, что может защитить ее от действия эндогенных нуклеаз, а также способствовать проникновению внутрь клеток (43). Адсорбция ДНК на катионные микрочастицы из поли(DL-лактид-ко-гликолида), ПЛГ – poly(DLlactide-co-glycolide), PLG – обеспечивает медленное высвобождение ДНК и приводит к формированию более мощного иммунного ответа, чем использование депротеинизированной ДНК (44). Обеспечивающая физическое облегчение транспорта нуклеиновых кислот внутрь клеток-мишеней электропорация в кожу(45) или мышечную ткань (46) оказалась перспективным подходом повышения эффективности переноса генов. Еще одним применимым к вакцинам методом повышения эффективности трансфекции является гидродинамическая доставка плазмидной ДНК (47). Применение этих подходов в клинических условиях требует тщательной оптимизации с учетом особенностей человеческого организма.
Легкость манипулирования рекомбинантной ДНК позволяет изменять закодированный в ней антиген для повышения его иммуногенности, при этом существует огромное количество различных типов манипуляций. Так как усвоение и адекватная презентация антигена являются обязательными условиями индукции эффективного иммунного ответа, некоторые группы исследователей модифицировали закодированные антигены таким образом, чтобы повысить эффективность их поглощения специализированными АПК (48). Комплексы антигенов с CD40-лигандом (49), внеклеточным доменом лиганда Fms-подобной тирозинкиназы-3 (flt-3) (50) или антигеном-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4) (51) являются примерами, в которых рецепторы к каждому из лигандов присутствуют на поверхности ДК и обеспечивают поглощение антигена клетками и формирование усиленного иммунного ответа. Внутри клетки закодированный антиген может модифицироваться для облегчения деградации с помощью эндосомально-лизосомального механизма (52,53), что усиливает презентацию антигена в комплексе с молекулами MHC II класса и стимулирует CD4+ Т-клеточные реакции. Сходный метод, влияющий на другой механизм, – протеолитическую обработку закодированного антигена – обеспечивается его слиянием с последовательностями, приводящими к его убиквитинизации (54). Встраивание гетерологичных иммуногенных последовательностей, таких как ЦТЛ-эпитоп столбнячного токсина, в последовательность опухолевого антигена приводило к быстрой стимуляции ЦТЛ против опухолевого антигена с одновременной защитой от опухолевой стимуляции (55). Для опухолей, ассоциированных с вирусом папилломы человека, таких как рак шейки матки, кодонная оптимизация гена вирусного антигена показала себя как эффективное средство повышения экспрессии белка в клетках млекопитающих и усиления иммунного ответа (56).
Другим подходом к повышению иммуногенности ДНК-вакцин является одновременное введение ДНК, кодирующей цитокины, обосновываемое тем, что более мощный иммунный ответ возможен в случае презентации антигена в благоприятном цитокинном микроокружении. Поэтому цитокины, стимулирующие опосредуемый Тх1 иммунный ответ, в том числе гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), интерферон-гамма (ИФН-гамма), интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-12 (ИЛ-12) и интерлекин-18 (ИЛ-18), активно изучались на доклинических моделях инфекционных заболеваний (57) и рака (58-60). Результаты исследований продемонстрировали способность этого подхода положительно воздействовать на природу и выраженность иммунного ответа. На основе утверждения, что более эффективное введение антигена внутрь АПК усилит иммунологическую реактивность, для привлечения АПК в зону синтеза антигенов использовали хемокины. Это достигалось либо путем слияния генов антигена и воспалительных хемокинов (61), либо путем одновременного введения генов антигена и хемокинов (62). К дополнительным стратегиям относятся одновременное введение антиапоптотических генов, способствующих выживанию ДНК-трансформированных ДК (63), и совместное введение кодирующей антиген ДНК и растворимого белка, кодируемого геном активатором лимфоцитов-3 (lymphocyte activating gene-3, LAG3), с целью усиления перекрестной презентации антигена (64). Увеличение количества ДК in vivo с целью повышения иммунологической реактивности стимулируют введением плазмиды, кодирующей flt-3-лиганд (65). Использование этого подхода в комбинации с традиционными пептидными вакцинами усиливает клеточный иммунный ответ (66).
Концепция перекрестно-видовой гомологичной иммунизации, также называемая ксеногенной или ортологичной иммунизацией, продемонстрировала свою эффективность при устранении толерантности к слабоиммуногенным опухолеспецифическим антигенам. Эта стратегия подразумевает выделение генов опухолевых антигенов из организмов другого вида с целью индукции перекрестно-видового иммунного ответа на аутологичный белок реципиента вакцины. Для многочисленных изученных на сегодняшний день белков ортологичный белок других видов обладает более выраженной иммуногенностью, чем аутологичный или собственный антиген. Этот подход ведет к развитию иммунитета, перекрестно реагирующего с собственным антигеном и устраняющим толерантность к нему. Ортологичную иммунизацию успешно использовали на животных моделях для индукции противоопухолевых иммунных реакций как против эндогенных опухолевых антигенов (67-70), так и против коканцерогенных факторов (71). Предварительные клинические исследования белково-дендритноклеточной вакцины против рака предстательной железы продемонстрировали стимуляцию иммунного ответа на собственный антиген, что свидетельствует о возможности переноса этого подхода в клиническую практику (72). Простота приготовления и отсутствие ассоциированного с ДНК-вакцинами иммунного ответа, направленного против вирусных векторов, привела к созданию на основе этого подхода ряда стратегий ксеногенного запуска и стимуляции иммунного ответа, которые в ряде доклинических моделей продемонстрировали более высокую эффективность по сравнению с ДНК-иммунизацией в чистом виде. К ним относятся использование ДНК-вакцин в комбинации с другими генетическими векторами (73,74) или с белками, например, абсорбированными на микрочастицы из ПЛГ (75). Несмотря на то, что подобные подходы несколько сложнее внедрять в клиническую медицину, повышение эффективности комбинированных вакцин может послужить решающим фактором.
7. Клинический опыт использования ДНК-вакцин
В то время как индукция как Т-, так и В-клеточного иммунного ответа на чужеродные антигены убедительно продемонстрирована на человеке по отношению к чужеродным антигенам, ассоциированным с инфекционными заболеваниями (76-79), применение ДНК-вакцин для лечения рака до сих пор было гораздо менее успешным. Индукция эффективного противоопухолевого иммунного ответа является сложной задачей, и на настоящий момент попытки клинического использования ДНК-вакцин приводили к противоречивым результатам. Клинические исследования подтвердили общую безопасность и низкую токсичность векторов, однако эффективность вызываемого ими иммунного ответа оказалась слабой, а противоопухолевая активность – сомнительной.
На сегодняшний день завершено уже несколько клинических исследований. Кодирующую клонированный опухолевый антиген (карциноэмбриональный антиген) ДНК вводили внутримышечно пациентам с поздними стадиями рака толстого кишечника (80). Пациентов иммунизировали плазмидами, одновременно экспрессирующими карциноэмбриональный антиген и, в качестве контроля, поверхностный антиген вируса гепатита В. В результате у некоторых пациентов регистрировались защитные уровни антител к вирусу гепатита, однако практически не развивался иммунитет против карциноэмбрионального антигена. Rosenberg и др. опубликовали сходные данные, полученные при введении ДНК, кодирующей антиген меланомы gp100, в рамках фазы I клинических исследований с участием пациентов с метастазирующей меланомой (81). При проведении этих исследований только у одного из 22 пациентов, перенесших внутримышечную или внутрикожную иммунизацию, наблюдалось развитие слабого неполноценного специфичного иммунного ответа против антигена gp100. Авторы пришли к выводу, что иммунизация не вызывала развития значимого клинического или иммунологического ответа. Этот факт противоречит результатам более ранних клинических исследований, при проведении которых антиген gp100 вводили в виде трансгена в составе вакцины на основе вируса оспы домашней птицы или в форме пептидов, и указывает на необходимость разработки стратегий усиления иммунного ответа на ДНК-вакцины на основе плазмид. Альтернативный метод введения – внутрь лимфоузлов – оценили на 26 пациентах с прогрессирующей меланомой (82). Введение плазмидной ДНК, кодирующей эпитопы тирозиназы, привело к развитию антигенспецифичного иммунного ответа у 11 пациентов. При этом у пациентов не наблюдалось никаких клинических изменений, кроме неожиданно высокой средней продолжительности жизни. Плазмидную ДНК, кодирующую простатоспецифический антиген (ПСА), вводили пациентам с гормонорезистентным раком предстательной железы в комбинации с цитокинами ГМ-КСФ и ИЛ-2 (83). При этом у двух из трех пациентов когорты, получившей наиболее высокую дозу, регистрировался клеточный и гуморальный иммунный ответ на ПСА и снижение уровня этого антигена.
Levy и др. оценили иммуногенность плазмидной ДНК-вакцины в исследованиях на пациентах с В-клеточной лимфомой (84). Более ранние клинические исследования с использованием для активной иммунизации белков, представляющих собой опухолеспецифические идиотипы иммуноглобулинов, продемонстрировали положительные клинические эффекты для пациентов (85, 86), однако приготовление индивидуальной вакцины для каждого пациента очень трудоемко и неприемлемо для широкого применения. ДНК-вакцинация обладает преимуществом сравнительно быстрого и малозатратного изготовления. Пациентов иммунизировали ДНК-вакциной, кодирующей химерную молекулу, состоящую из специфичного для пациента идиотипа, соединенного с а- и k-цепями константной области мышиного иммуноглобулина G2 (IgG2). Когорты пациентов иммунизировали внутримышечно и внутрикожно с помощью безыгольных устройств типа Biojector с добавлением или без добавления плазмидной ДНК, кодирующей ГМ-КСФ. У большинства пациентов всех когорт наблюдалось развитие иммунного ответа на белок-носитель мышиного иммуноглобулина, что послужило доказательством синтеза закодированного белка и его способности вызывать иммунный ответ. Индукция иммунного ответа на опухолеспецифический идентификационный фрагмент закодированного гена также регистрировалась, хотя и у меньшего количества пациентов. Клиническую эффективность вакцины было трудно оценить из-за предварительной и проводимой во время исследований химиотерапии и отсутствия невакцинированной группы контроля. Тем не менее, отсутствие токсичности и развитие регистрируемого иммунного ответа свидетельствуют в пользу целесообразности дальнейшего усовершенствования этого подхода к вакцинации.
Следует отметить, что упомянутые клинические исследования проводили в условиях поздних стадий заболеваний, на которых индукция иммунного ответа не является оптимальным подходом к лечению. Тем не менее, в целом полученный опыт использования депротеинизированной ДНК для иммунотерапии указывает на то, что введения плазмидных ДНК-вакцин недостаточно для формирования клинически эффективного иммунного ответа на немутировавшие собственные антигены. Перенос наиболее перспективных из перечисленных в табл. 1 стратегий в клиническую практику может помочь в преодолении ограничений, присущих существующим методам.
Опубликованы результаты двух фаз I клинических исследований вакцины против злокачественных заболеваний, ассоциированных с папилломавирусом человека. Иммунотерапию таких опухолей облегчает тот факт, что их клетки экспрессируют чужеродные вирусные антигены. Плазмидную ДНК, кодирующую пептидные эпитопы (фрагменты белка, распознаваемые антителами) белка Е7 человеческого папилломавируса 16 типа, презентируемые АПК в комплексе с антигенами MHC класса I, инкапсулировали в микрочастицы из биоразрушаемого полимера ПЛГ и вводили внутримышечно (87). Анализ с помощью тест-систем ELISPOT показал усиленные Т-клеточные реакции у 10 из 12 пациенток с дисплазиями. В то же время, у некоторых пациентов из когорт, получивших наибольшие дозы вакцины, наблюдалось развитие неполноценных тканевых реакций. Внутримышечное и подкожное ведение того же препарата женщинам с интраэпителиальной цервикальной неоплазией приводило к формированию у большинства пациенток (73%) регистрируемого иммунного ответа на белок Е7 человеческого папилломавируса 16 типа и у 33% пациенток – полноценного тканевого ответа (88). При этом не наблюдалось никаких связанных с вакцинацией серьезных побочных эффектов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ДНК-вакцины против антигенов папилломавируса могут играть важную роль в борьбе с ассоциированными с ним злокачественными заболеваниями.
За последние несколько лет скорость идентификации опухолевых антигенов значительно увеличилась (89) и будет продолжать расти, поскольку внедрение новых методик, таких как профилирование экспрессии (90, 91), технология SEREX (serological identification of antigens by recombinant expression cloning) (92) и протеомный анализ (93), обеспечивает идентификацию новых потенциальных мишеней для активной иммунотерапии. Использование ДНК-вакцин в доклинических моделях является сравнительно быстрым методом оценки потенциальной пригодности таких антигенов-кандидатов для стимуляции отторжения опухолей. Кроме традиционных опухолеспецифических антигенов, в качестве мишеней для ДНК-вакцин могут выступать антигены сосудистой сети опухолей (94, 95). Работа над созданием ДНК-вакцин в области борьбы с инфекционными заболеваниями не потеряет свою ценность с точки зрения разработки новых стратегий, пригодных для использования при создании противоопухолевых вакцин. Результаты недавно проведенного клинического исследования инфекционного заболевания (малярии) свидетельствуют о том, что различные стратегии иммунизации, направленной на запуск и усиление иммунного ответа, с использованием ДНК в комбинации с другими типами вакцинации может потенцировать иммунный ответ у человека (96). Несмотря на то, что окончательные клинические доказательства эффективности ДНК-вакцин в терапии рака еще предстоит получить, есть поводы сохранять оптимизм по поводу их потенциала в борьбе с широким спектром злокачественных новообразований. Как сравнительно нетоксичная терапия, ДНК-иммунизация может найти свое клиническое применение в качестве дополнительной меры при лечении минимальной резидуальной болезни для предотвращения рецидивов заболевания. Со временем ДНК-вакцины могут стать средством профилактики рака. Значительные преимущества ДНК-иммунизации и ее доказанная в клинических исследованиях безопасность являются вескими доводами в пользу продолжения разработки таких вакцин и их внедрения в практику борьбы со злокачественными заболеваниями.
Исследование проведено за средства грантов NCI 1 P50 CA89019 и NCI 1 P50 CA83591, выделенных Национальными институтами здравоохранения США.